ژانویه 24, 2021

بررسی تاثیر سطوح تغذیه ای اسانس سنبل کوهی و مرزن جوش بر …

1 min read

مقدار

۵X Reaction Buffer

μl 4

RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase

μl 1

RiboLock RNase Inhibitor

μl 1

۱۰ mM dNTP Mix

μl 2

حجم کل

μl 20

در ادامه تیوپ ها را در دمای °۴۲ به مدت ۶۰ دقیقه برای مرحله اول واکنش و دمای °۷۰ به مدت ۵ دقیقه برای پایان واکنش درون دستگاه قرار دادیم.
بعد از پایان مراحل فوق تیوپ های محتوی cDNA تا زمان استفاده در واکنش های Real Time-pcr در دمای °۷۰- نگهداری شد.
۳-۳-۷-تعیین غلظت و خلوص cDNA
برای تعیین غلظت و خلوص cDNA از دستگاه اسپکتروفتومتر Thermo استفاده گردید که قادر به تشخیص طیف وسیعی از عملکردها برای اندازهگیری نوکلئیک اسید و پروتئینها میباشد. یکی از کاربردهای این دستگاه تعیین و محاسبه غلظت و خلوص RNA و DNAمیباشد. بدینمنظور ابتدا مقدار ۲ میکرولیتر آب تیمار شده با DEPC (جهت استانداردسازی) را در دهانه فیبرنوری دستگاه قرار داده و بازوی دستگاه را بر روی نمونه قرار میدهیم. سپس بازو را بلند کرده و با دستمال یا پنبه استریل مایع را برداشته و ۲ میکرولیتر از نمونه استخراج شده را در دهانه فیبرنوری قرار داده و بازو را بر روی آن قرار میدهیم. در نهایت محاسبه غلظت و سایر پارامترها نیز انجام میشود.
۳-۳-۸-ارزیابی و رقیق سازی و همسان سازی غلظت cDNA
پس از تعیین کمیت و کیفیت cDNA سنتز شده از نمونه های مربوط به بافت کبد با نانودراپ برای انجام Real time PCR باید تمام cDNAها را رقیق شده وبه یک غلظت مشخص رسانده شود که در این مطالعه تمام cDNAها رقیق شد و به غلظت حدود ng/µl 300 رسید و سپس غلظت cDNAها توسط نانودراپ تایید شد.
۳-۳-۹-طراحی آغازگرها
معیارهای عمومی برای آغازگرها بسیار ساده است، با این حال انتخاب آغازگر خوب برای داشتن محصول اختصاصی دشوار است. از آنجا که یک جفت آغازگر اختصاصی باید فقط یک قطعه منحصر به فرد از کل ژنوم را تکثیر کند، انتخاب آغازگر مناسب برای PCR، هیبریدسازی توالی های کوچک و توالی یابی DNA بسیار مهم می باشد. به این منظور با در نظر گرفتن شرایط و ویژگی های یک آغازگر مناسب برای واکنش RT-PCR، اقدام به طراحی آغازگرها شد. در مرحله اول، توالی نوکلئوتیدی ژن های هدف و مرجع از بانک اطلاعات ژنی، پایگاه NCBI به فرمت FASTA دریافت گردید. سپس با استفاده از نرمافزار Primer premier نسخهی ۵ نسبت به طراحی آغازگرهای اختصاصی اقدام شد. سپس با استفاده از ابزار قدرتمند Blast و پایگاه دادهای همچون PT Primer Data base از یکتا بودن محل اتصال جفت آغازگرها و ساختمان فضایی آنها اطمینان حاصل شد. سنتز آغازگرها توسط شرکت سینا کلون صورت گرفت.
جدول۳-۶- آغازگرهای مورد استفاده در فرآیند Real –Time PCR

دانلود متن کامل این پایان نامه در سایت abisho.ir
Copyright © All rights reserved. | Newsphere by AF themes.