ژانویه 22, 2021

بررسی تاثیر سطوح تغذیه ای اسانس سنبل کوهی و مرزن جوش بر بیان …

1 min read

جیره پایه + ۲۰۰ میلی گرم در کیلوگرم اسانس مرزن جوش
جیره پایه + ۴۰۰ میلی گرم در کیلوگرم اسانس مرزن جوش
۳-۲-۱۰-متغیرهای مورد بررسی در آزمایشهای مزرعهای
۳-۲-۱۰-۱-میانگین وزن بدن
در پایان هر دوره هفت روزه، وزنکشی جوجههای هر تکرار به صورت گروهی و دو ساعت بعد از قطع دان، با استفاده از ترازوی دیجیتال با دقت ۱۰  گرم انجام گردید. متوسط وزن بدن هر جوجه در هر سن از تقسیم وزن جوجههای هر تکرار در آن سن بر تعداد پرندههای زنده در همان سن محاسبه شد.
۳-۲-۱۰-۲- خوراک مصرفی
مقدار خوراک مصرفی هر تکرار به طور هفتگی اندازهگیری شد. به طوری که هر هفته با توجه به هفته قبل مقدار مشخصی خوراک توزین و در هر باکس توزیع گردید. در پایان هر هفته نیز قبل از وزنکشی جوجهها، دان باقیمانده در دانخوریها جمعآوری و بعد از وزن کشی جوجهها، توزین شد. متوسط خوراک مصرفی روزانه هر جوجه به صورت هفتگی و همچنین در کل دوره مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. به طور کلی متوسط خوراک مصرفی روزانه هر جوجه از رابطه زیر محاسبه شد.
متوسط خوراک مصرفی هر جوجه در هر دوره (گرم)
مقدار دان داده شده در هر دوره (گرم)
مقدار دان باقیمانده در هر دوره (گرم)
تعداد مرغ هر دوره
۳-۲-۱۰-۳- ضریب تبدیل غذایی
محاسبه ضریب تبدیل غذایی در هر مقطع پرورش، از تقسیم گرم خوراک مصرفی بر وزن پرنده در همان سن به دست آمد.
ضریب تبدیل غذایی (گرم:گرم)
مقدار خوراک مصرفی در طول دوره مورد نظر (گرم)
وزن پرنده در انتهای دوره مورد نظر (گرم)
۳-۳-مراحل آزمایشگاهی اثرات سطوح مختلف اسانس سنبل کوهی و مرزن جوش بر بیان ژن Muc2 در جوجه های گوشتی
۳-۳-۱-کشتار حیوانات آزمایشی و نمونه برداری
در پایان دوره رشد در سن ۴۲ روزگی از هر باکس یک قطعه جوجه کشتار شده و نمونه هایی از بافت روده برای بررسی بیان ژنMuc2 جدا شد، نمونه های جمع آوری شده پس از انتقال به آزمایشگاه در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
۳-۳-۲-بیان ژن
به منظور بررسی بیان ژنMuc2 ابتدا با استفاده از کیت استخراج RNA GeneJET RNA Purification Kit)) شرکت فرمنتاز مجموعRNA از کبد استخراج گردید و ارزیابی کیفیت و کمیت RNA با استفاده از نانودراپ صورت گرفت، سپس سنتز cDNA با استفاده از کیت (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit) ساخت شرکت فرمنتاز و با توجه به دستور عمل شرکت فرمنتاز صورت گرفت. در ادامهmRNA موجود با استفاده از کیت سایبرگرین(Maxima SYBER Green qPCR Master Mixes) ساخت شرکت فرمنتاز اندازه گیری شد.
مراحل کار به ترتیب زیر است:
۱- استخراج RNA کل از بافت روده
۲- تشکیل cDNA از نمونههای mRNA
۳-انجام PCR برای بدست آوردن دمای اتصال پرایمر به ژنMuc2
۴- انجام واکنشهای Real-time RT-PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی برای هر یک از ژنهای مورد نظر
۵-اندازگیری کمی محتوی mRNA هر نمونه (تعیین سطح بیان ژن) از طریق مقایسه منحنیهای حاصله با منحنی استاندارد حاصل از یک ژن house keeping مانندGAPDH
۳-۳-۳-استخراج RNA از بافت روده
جداسازی RNA از بافت روده با کمک کیت استخراج RNA تولیدی شرکت فرمنتازGeneJET RNA Purification Kit صورت گرفت. این کیت دارای لوله های فیلتر دار، لوله جمع آوری کننده ۵/۱ و ۲ میلی لیتری، آب بدون آنزیم RNase و بافرهای لیزکننده، ، محلول شستشوی شماره ۱ و ۲ بود. تمامی مراحل کار مولکولی در شرایط استریل و در زیر هود بیولوژیک انجام شد. فیلترها، دارای غشای سیلیکونی بودند که طی انجام روند جداسازی در حضور بافرها، RNA به این غشاء چسبیده و در پایان به وسیله آب بدون RNA شسته، جمع آوری و در دمای ۷۵- درجه سانتی گراد قرار داده شده و سپس برای ساخت cDNA به کار برده شد.
جداسازی RNA شامل مراحل زیر بود:
الف) سی میلیگرم از بافت روده یخ زده در دمای ۷۵- درجه سانتی گراد جدا شده و به سرعت و پس از یخ گشایی کامل به درون بوته چینی انداخته شد، بافت بخوبی کوبیده و آسیاب شد. سپس ۳۰۰ میکرولیتر از محلول لیزکننده به نمونه اضافه شد.در ادامه بافت را روده به همراه محلول لیز کننده کوبیده تا بافت بطور کامل متلاشی و در نهایت بافت هموژنیزه شود. سپس ۱۰ میکرولیتر پروتئناز K به محلول اضافه میکنیم وسپس محلول را پیپتینگ می کنیم. در ادامه ۵۹۰ میکرولیتر آب مقطر به محلول اضافه میکنیم وسپس محلول حاصل را داخل یک میکرو تیوپ ۵/۱ میلی لیتری منتقل می کنیم.
ب- برای یکنواختی بیشتر بافت به مدت ۱-۲ دقیقه ورتکس انجام شد سپس تیوپ محتوی محلول به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه در دمای۲۰ درجه سانتیگراد در داخل حمام بن ماری قرار گرفت.
پ- در این مرحله نمونه را به مدت ۱۰ دقیقه و با سرعت ۱۲۰۰۰ دور داخل سانترفیوژ قرار دادیم و پس از اتمام این مرحله مایع رویی داخل تیوپ را به یک میکروتیوپ ۵/۱ میلی لیتری جدید منتقل کردیم.
ت-در این مرحله ۴۵۰ میکرولیتر الکل ۹۶% به تیوپ اضافه کرده و محلول حاصل را خوب تکان میدهیم.
سپس ۷۰۰ میکرو لیتر از محلول فوق را به یک تیوپ فیلتر دار منتقل کرده و به مدت ۱ دقیقه و با سرعت ۱۲۰۰۰ دور داخل سانترفیوژ قرار دادیم.
ث-پس از این مرحله مایع موجود در انتهای تیوپ فیلتردار را دور ریخته و بقیهی محلول موجود در تیوپ ۵/۱ را به تیوپ فیلتر دار اضافه کرده و مجددا به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰ دور داخل سانترفیوژ قرار دادیم و بعد از اتمام سانترفیوژ مجدد مایع موجود در انتهای تیوپ را دور میریزیم.
ج-۷۰۰ میکرو لیتر محلول شستشوی۱ (۱ wash buffer) را به تیوپ فیلتر دار اضافه کردیم و تیوپ را به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰ دور داخل سانترفیوژ قرار دادیم بعد از اتمام سانترفیوژ مایع موجود در انتهای تیوپ را دور میریزیم.
چ-۶۰۰ میکرو لیتر محلول شستشوی۲ (۲ wash buffer) را به تیوپ فیلتر دار اضافه کردیم و تیوپ را به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰ دور داخل سانترفیوژ قرار دادیم بعد از اتمام سانترفیوژ مایع موجود در انتهای تیوپ را دور میریزیم.
ح-۲۵۰ میکرو لیتر محلول شستشوی۲ (۲ wash buffer) را به تیوپ فیلتر دار اضافه کردیم و تیوپ را به مدت ۲ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰ دور داخل سانترفیوژ قرار دادیم بعد از اتمام سانترفیوژ ستون جمع کننده مایع را به همراه مایع درون آن دور انداخته و ستون را به یک تیوپ ۵/۱ جدید منتقل میکنیم.
خ-در این مرحله ۱۰۰ میکرولیتر آب بدون RNA به تیوپ اضافه کرده و و به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰دور داخل سانترفیوژ قرار دادیم.
ذ-برای گرفتن حداکثر RNA ، مجددا ۱۰۰ میکرولیتر آب بدون RNA به تیوپ اضافه کرده و به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰ دورداخل سانترفیوژ قرار دادیم سپس ستون را برداشته وآنچه در تیوپ باقی میماند مایع حاوی RNA میباشد که برای ساخت cDNA مورد استفاده قرار میگیرد.
۳-۳-۴-روش نگهداری RNA استخراج شده
بهتر است RNAی استخراج شده از بافت هرچه زودتر برای کار و ساخت cDNA مورد استفاده قرار گیرد .در مواردی که نیاز به نگهداری نمونه است در ابتدا نیتروژن مایع و سپس فریزر ۸۰- درجه سانتی گراد توصیه میشود. در این شرایط تا ۴ ‏ماه ‏نمونه قابل نگهداری است.
۳-۳-۵-طیف سنجی RNAهای استخراجی با Nanodrop
پس از استخراج RNA از بافت کبد برای اطمینان از صحت کار و غلظت مناسب RNA برای سنتز cDNA، غلظت RNAها با نانودراپ اندازهگیری شدند.
۳-۳-۶-سنتز cDNA از نمونه های RNA

برای دانلود فایل متن کامل پایان نامه به سایت 40y.ir مراجعه نمایید.
Copyright © All rights reserved. | Newsphere by AF themes.