ژانویه 23, 2021

ردیابی هیستوموناس مله اگریدیس در بوقلمون های کشتارشده دراستان اصفهان۹۳- قسمت ۱۰

1 min read

برای انجام PCR دو پرایمر مکمل DNA مورد احتیاج است این دو پرایمر در جهت مخالف با DNA هدف هیبرید می‌شوند DNA بین آن تکثیر می‌یابد. برای سنتز DNA، یک DNA پلی مراز مقاوم به حرارت مورد نیاز است. آنزیم (Taq) پلی مراز که از یک باکتری گرما دوست به نام ترموس اکواتیکوس بدست می‌آید. به عنوان مهم ترین آنزیم مورد استفاده برای PCR محسوب می‌گردد.
۲-۴-۱- مواد و وسایل لازم برای انجام برای انجام آزمایش PCR
– DNA هدف
– PCR Buffer 10X
– آنزیم DNA پلی مراز (Taq DNA Polymerase 5u/ul )
– نوکلئوتید‌ها یا دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP 10Mm)
– کلرورمنیزیم (MgCl2 50Mm )
– پرایمر
– بافر PCR و کمک کننده ها
– آب مقطر
– میکروتیوب ۵/۰ میلی لیتری
– میکروسانتریفیوژ
۲-۴-۲- سنتز
سنتز چند مرحله دارد :
۱-مرحله واسرشت سازی قطعات DNA
در این مرحله حرارت باعث تک رشته‌ای شدن ملکول‌های دو رشته‌ای DNA در حضور آغاز گرها، چهار نوع dNTP¸ بافرPCR و آنزیم DNA پلی مراز مقاوم به حرارت می‌شود. درجه حرارت این مرحله معمولا بین ۹۵-۹۳ درجه سانتی گراد است.
۲-مرحله هم سرشت سازی:
با پایین آوردن درجه حرارت تا حد ۶۵-۳۷ درجه سانتی گراد بسته به TM مورد استفاده موجبات اتصال آغازگرها به DNA تک رشته شده فراهم می‌آید. پرایمرها ۳۰-۱۸ نوکلئوتید می‌باشند و اگر امکان داشته باشد پرایمرها را به گونه‌ای طراحی می‌کنند که TM پرایمر‌ها یکسان باشند.
برای بدست آوردن TMپرایمر هااز فرمول زیر استفاده می‌شود :
(تعداد بازهایC¸G) ×۴+(تعداد بازهایTM=2×(T¸A
درجه حرارت مناسب برای جفت شدن پرایمر و DNA هدف ۵-۳ درجه سانتی گراد زیر TM می‌باشد چون آنزیم پلی مراز در درجه حرارت‌های مختلف فعال است از همان درجه حرارت لازم برای جفت شدن پرایمر و DNA هدف به منظور طویل شدن DNA نیز استفاده می‌شود.
۳-بسط آغازگرها :
در این مرحله آنزیم DNA پلی مراز از ۳ انتهای پرایمر همانند سازی می‌کند. این آنزیم در ۷۲ درجه سانتی گراد بین ۴۵ تا ۱۰۰ نوکلئوتید در ثانیه همانند سازی می‌کند که این میزان بستگی به PH بافر غلظت نمک و DNA هدف دارد. سپس این فرایند حداقل برای ۲۰ سیکل دیگر تکرار می‌شود.
در فرایند PCR¸ درجه حرارت ۹۷-۹۴ درجه سانتی گراد برای جدا شدن دو زنجیره DNA و ۷۵-۵۵ درجه سانتی گراد برای همانند سازی لازم است ولی نهایتا سیکل آخر همانند سازی[۲۲] ۵ دقیقه طول می‌کشد تا تمامDNA به رشته‌های دو زنجیره‌ای تبدیل شود.
۲-۴-۳- تشخیص و تجزیه فراورده‌های PCR:
فراورده‌های PCR عبارت از یک قطعه (یا قطعاتی) از DNA هستند که طول آنها معمولا برابر با ناحیه حد وسط در آغاز گر می‌باشد.
برای تشخیص و تعیین هویت قطعات تکثیر یافته از روش‌های مختلف می‌توان سود برد که این موارد عبارتند از :
الف) ژل الکتروفورز
ب) تشخیص آنی ناحیه تکثیری
ج) تشخیص ایمونولوژیکی فراورده‌های PCR
د) ارزیابی به وسیله جرقه با SPA[23]
از مجموع موارد فوق تنها به توزیع مختصری در مورد روش ژل الکتروفورز که آسانترین و متداول ترین روش مورد استفاده است می‌پردازیم.
ژل الکتروفورز :
آسانترین، متداول ترین روش مورد استفاده برای تشخیص و تجزیه فراورده PCR الکتروفورز است. الکتروفورز مقداری از فراورده‌های PCR بر روی ژل آگارز یا ژل پلی اکریلامید، رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید( یک ماده رنگی که دارای خاصیت فلورسنت است) و آنگاه مشاهده ژل در زیر فرابنفش(uv) یکی از ساده ترین روش‌ها برای تشخیص و بررسی فراورده‌های PCR پس از رنگ آمیزی و با تابش نور uv به ژل مشاهده DNA و ژل، امکان پذیر می‌گردد. حال می‌توان از ژل عکس برداری کرد و نتیجه را ثبت کرد.
مارکر‌های مقیاسی و فراورده‌های PCR مربوط به کنترل آزمایش را می‌توان در چاهک‌های جانبی ژل قرار داد تا امکان تعیین دقیق اندازه قطعات تکثیر شده فراهم آید. مارکر‌های DNA در اندازه‌های مختلف به صورت تجاری قابل تهیه می‌باشند.
فصل سوم
«مواد و روش کار»
۳-۱- نمونه گیری

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت zusa.ir مراجعه نمایید.

Copyright © All rights reserved. | Newsphere by AF themes.