ژانویه 23, 2021

ردیابی هیستوموناس مله اگریدیس در بوقلمون های کشتارشده دراستان اصفهان۹۳- قسمت ۱۲

1 min read

-اتیدیوم بروماید
-آب مقطر
-سمپلر در حجم های مختلف
-سر سمپلر زرد و آبی
-دستگاه ماکروویو
-ترازوی دیجیتال
-ظروف شیشه ای آزمایشگاهی
– قالب و شانه مخصوص ژل
-تانک الکتروفورز
– منبع تنظیم ولتاژ برق[۲۶]
-دستگاه تصویر بردار ژل[۲۷]
۳-۵-۲- روش تهیه بافر (۱X) TBEبرای تهیه ژل آگارز
مقادیر ۹۹/۱۰۸ گرم از پودرTris base، ۶۵/۵۵ گرم ازپودر Buric Acid و ۴۴/۱ گرم از پودر EDTA را با یکدیگر مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم ml1000 رسانده تا TBE (10X) ساخته شود. سپس (۱۰X)TBE را به نسبت۱به ۱۰ با آب مقطر مخلوط کرده تا TBE با غلظت ۱X تهیه شود.
۳-۵-۳- روش تهیه ژل آگارز
برای ساخت ژل آگارز ۱% پودر آگارز را به میزان ۳/۰ گرم وزن کرده و با ml30 بافر (۱X) TBE مخلوط کرده و حرارت داده تا پودر آگارز ذوب شود و در بافر TBE کاملاً حل شود و پس از آنکه حرارت محلول حاصل کاهش یافت مقدار ۲ میکرولیتر محلول اتیدیوم بروماید (mg/ml 10) اضافه گردید. سپس محلول حاصل را در قالب مخصوص ژل (Cast) ریخته و شانه ژل (Comb) را جهت تعبیه چاهک داخل ژل قرار داده و اجازه می دهیم تا ژل منعقد شود.
۳-۵-۴- روش انجام الکتروفورز
۱-شانه ژل را از ژل خارج کرده و ظرف ژل را به همراه قالب آن در تانک الکتروفورز حاوی بافر TBE(1X) قرار داده به طوری که بافر تمام سطح ژل را بپوشاند.
۲-مقدار ۵ میکرو لیتر از نمونه‌های DNA استخراج شده با ۲ میکرولیتر Buffer 6X مخلوط می‌گردد و درون چاهک‌ها ریخته می‌شود.
۳-تانک الکتروفورز به منبع جریان Power Supply وصل شد و ولتاژ دستگاه روی ۸۰ ولت تنظیم می‌گردد.
۴-پس از حدود ۲۰-۳۰ دقیقه جریان ولتاژ را قطع نموده و ژل را برای بررسی روی دستگاه uvidoc قرار داده و پس از بررسی صحت DNA استخراج شده از آن عکس گرفته شد.
۳-۵-۵- آنالیز محصول PCR:
محصول PCR بر روی ژل ۱ درصدآگارز با ولتاژ ۸۰ ولت برای مدت ۳۰ دقیقه الکترفورز گردید سپس ژل مورد نظر با اتیدیم بروماید رنگ آمیزی و با دستگاه UV doc مشاهده شد.
۳-۶- آزمایشات هیستوپاتولوژی
برای رنگ آمیزی بافت‌ها از روش رنگ آمیزی استاندارد با نام ائوزین هماتوکسیلین استفاده شد.
برای انجام آزمایشات هیستوپاتولوژی، نمونه‌های بافتی که قبلا در فرمالین ۱۰% قرار داده شده بودند جهت تهیه لام به آزمایشگاه ارسال و پس از تهیه لام هیستوپاتولوژی به روش هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) رنگ آمیزی گردید، که در ادامه مختصری درباره این روش رنگ آمیزی توضیح داده خواهد شد.
۳-۶-۱- رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) :
طریقه ساخت رنگ هماتوکسیلین :
مواد مورد نیاز :
۱-پودر هماتوکسیلین: ۵ گرم
۲-الکل اتیلیک: ۵۰ سی سی
۳-پتاسیم آلوم : ۱۰۰ گرم
۴-آب مقطر : ۹۵۰ سی سی
۵-اکسید مرکوریک : ۲/۵ گرم
۶-اسید استیک : ۴ سی سی
رنگ هماتوکسیلین را در ارلن کوچک ریخته و به آن الکل اضافه می‌کنیم. به کمک حرارت روی بخاری یا داخل بن ماری ۵۶ درجه، رنگ را داخل الکل خوب حل می‌کنیم. پودر پتاسیم آلوم را در یک ارلن مناسب ریخته و به آن آب مقطر اضافه می‌کنیم به کمک حرارت و تکان دادن مکرر پودر را داخل آب مقطر حل می‌کنیم، در حالی که این محلول گرم است. محلول الکلی هماتوکسیلین را به آن اضافه می‌کنیم و محتوای ارلن را حرارت داده و مرتب تکان می‌دهیم. هنگامی که محلول جوش آمد، بی درنگ در کم تر از ۱ دقیقه ارلن را از حرارت دور کرده و با احتیاط پودر اکسید مرکوریک را اضافه می‌کنیم، مجددا محلول را حرارت می‌دهیم تا رنگ ارغوانی تیره ظاهر شود. سپس محلول را از حرارت دور کرده میگذاریم تا سرد شود. اسید استیک اضافه می‌کنیم، بعد از آن محلول را صاف می‌کنیم. در این موقع محلول قابل استفاده است ولی بهتر است ۲ تا ۴ هفته رنگ بماند بعد مورد استفاده قرار گیرد.
ساخت رنگ ائوزین
رنگ ائوزین : گرم، الکل خالص : ۱۳۰ سی سی
رنگ ائوزین را در الکل حل کرده، قبل از استفاده به ازای هر ۱۰۰ سی سی محلول رنگ ۵/۰ سی سی اسید استیک اضافه گردد. این محلول رنگ استوک (ذخیره) است که هنگام استفاده باید به نسبت یک حجم رنگ با دو حجم الکل ۸۰ درجه رقیق گردد.

برای دانلود فایل متن کامل پایان نامه به سایت 40y.ir مراجعه نمایید.

Copyright © All rights reserved. | Newsphere by AF themes.