ژانویه 24, 2021

مقاله علمی با منبع : مطالعه تنوع ژنتیکی ۲۹ ژنوتیپ مختلف برنج بر اساس صفات گیاهچه ای و …

1 min read

.

.
.
.

.
.
.

واسرشتهسازی
اتصال آغازگر
بسط آغازگر

۱-۹۴
۵۵
۷۲

۴۵
۴۵
۶۰

۱۰

واسرشتهسازی
اتصال آغازگر
بسط آغازگر

۹۴
۵۵
۷۲

۴۵
۴۵
۲۵

۲۶

بسط نهایی [۵۹]

۷۲

۳۰۰

۱

۳-۴- الکتروفورز ژل عمودی

۳-۴-۱- شستشو و آمادهسازی دستگاه الکتروفورز

از آنجا که آللهای ریزماهواره تفاوتهایی در حدود چند جفت باز دارند لذا امکان جداسازی و تفکیک آنها از یکدیگر با استفاده از سیستمهای الکتروفورز افقی و ژل آگارز به روش معمول وجود ندارد. بنابراین از سیستم الکتروفورز عمودی و بستر ژل پلیاکریلامید برای جداسازی آللهای ریزماهواره استفاده میشود. در این مطالعه، دستگاه الکتروفورز عمودی توالییاب Bio-RAD در اندازه ۳۰×۳۸ سانتیمتر و به ضخامت ۴/۰ میلیمتر استفاده شد که عمدتا برای مطالعات تعیین توالی ژنها مورد استفاده قرار میگیرد. شیشههای ژل دو بار با الکل ۷۰ درصد شستشو داده شد و سپس با آب مقطر شسته شد. برای تیمار شیشه بزرگ از محلول بایند سیلن[۶۰] (مخلوط اتانول ۹۶ درصد (۹۵۰ میکرولیتر)، اسید استیک (۵ میکرولیتر) و بایند سیلن (۲ میکرولیتر)) استفاده گردید. این محلول باعث چسبیدن ژل به شیشه بزرگ میشود (ربیعی، ۱۳۸۲). محلول بایند سیلن بر روی شیشه ریخته شد و بلافاصله با استفاده از تکه کوچک کاغذ صافی، تمامی سطح شیشه به محلول آغشته گردید. جهت حرکت دست در هنگام آغشته کردن شیشه به محلول در یک جهت بود و یک سانتیمتری بالای شیشه که محل قرارگیری شانه بود تیمار نگردید، زیرا در صورت تیمار شدن، بارگذاری نمونهها و جدا کردن شانه از شیشه مشکل میشد. (قابل ذکر است که به علت سمی بودن بایند سیلن تیمار شیشه باید در زیر هود تهویه انجام گیرد). شیشه کوچک یا شیشه تانک با اتانول ۹۶ درصد کاملا تمیز شد. از دستکشهای جداگانهای برای تیمار کردن دو شیشه استفاده شد، به طوری که هیچ وقت از دستکش آغشته به یک ماده برای تیمار کردن شیشه دیگر استفاده نشد. در صورتی که شیشه کوچک به بایند سیلن آغشته گردد، تنها راه از بین بردن آن قرار دادن شیشه به مدت حدود یک ساعت در محلول ۱۰ درصد سود (هیدروکسید سدیم) میباشد. دستگاه الکتروفورز پس از تیمار و آماده شدن به صورت افقی خوابانده شد و کاملا تراز گردید. برای شروع واکنش با توجه به حجم ظرف، برای تهیه ۶۰ میلیلیتر ژل پلیاکریلامید واسرشتهساز به غلظت ۶ درصد اکریلامید ۴۰ درصد (۹ میلیلیتر)، X) 5TBE([61] (۱۲ میلیلیتر) و اوره (۲۲/۲۵ گرم) با هم مخلوط شدند و حجم آنها با آب دو بار تقطیر استریل به ۶۰ میلیلیتر رسانده شد (کرست و همکاران، ۲۰۰۱). مخلوط فوق بر روی همزن مغناطیسی قرار گرفت تا اوره به طور کامل حل شود. برای جلوگیری از ایجاد حباب محلول ژل به مدت ۲۰ دقیقه در حمام اولتراسیون قرار گرفت و سپس مقدار ۴۰۰ میکرولیتر آمونیوم پرسولفات ۱۰ درصد و ۴۰ میکرولیتر محلول تجاری تمد[۶۲]، اضافه گردید و پس از اینکه محلول ژل کاملا هم زده شد، بلافاصله با استفاده از سرنگ در قالب ژل تزریق گردید. این مرحله باید خیلی سریع و با دقت فراوان انجام گیرد تا هنگام تزریق محلول ژل حباب ایجاد نشود. آنگاه شانه مخصوص (شانه دندان کوسهای) از سمت پشت در عمق حدود یک سانتیمتری دهانه ژل قرار داده شد تا مانع ریختن ژل شود و در ضمن سطح ژل به صورت یک خط مستقیم ببندد. پس از حدود یک ساعت ژل به خوبی منعقد و آماده استفاده میباشد. پس از بستهشدن ژل، پایه ژل جدا گردید و قالب ژل به دستگاه الکتروفورز (Bio-RAD Sequi-Gen GT Sequencing Cell) منتقل شد. بافر مورد نیاز برای انجام عمل الکتروفورز، بافر TBE با غلظت (X 1) بود که از رقیق کردن بافر X) 5 TBE (با آب مقطر بدست آمد. میزان بافر برای هر تانک بسته به نوع سیستم و ابعاد ژل متفاوت بود. در مدتی که ژل میبست، نمونهها آماده شدند (ربیعی، ۱۳۸۲).

دانلود متن کامل این پایان نامه در سایت abisho.ir
Copyright © All rights reserved. | Newsphere by AF themes.