ژانویه 16, 2021

پژوهش – مطالعه تنوع ژنتیکی ۲۹ ژنوتیپ مختلف برنج بر اساس صفات گیاهچه ای و آزمایشات مولکولی، آزمایشی …

1 min read

پس از آمادهکردن سیستم و قبل از بارگذاری نمونهها در چاهکهای ژل، ابتدا سیستم با توان ثابت ۷۰ وات به مدت لازم جهت رسیدن دما به ۵۰ درجه سانتیگراد راهاندازی شد. دلیل این کار استفاده از بستر ژل اکریلامید واسرشتهساز است که نیاز به گرم شدن اولیه قبل از بارگذاری محصولات PCR دارد. به این مرحله، مرحله پیشران نیز میگویند. بعد از رسیدن دمای ژل به ۵۰ درجه سانتیگراد جریان برق قطع و شانه دندان کوسهای به آرامی برداشته شد. سپس سطح ژل با پیپت کردن به آرامی تمیز شد و مجددا شانه از طرف دندانهها در محل مناسب خود قرار گرفت و سیستم آماده بارگذاری محصولات PCR گردید.

۳-۴-۲- بارگذاری نمونهها و انجام الکتروفورز

مقدار ۲ میکرولیتر محلول رنگی بارگذاری یا دای فرمامید[۶۳] (۱ میلیگرم بروموفنل بلو، ۱ میلیگرم زایلن سیانول، ۲۰ میکرولیتر EDTA 10 میلیمولار و ۱ میلیلیتر فرمامید) به ۴ میکرولیتر محصول PCR اضافه شد و نمونهها قبل از بارگذاری درون چاهکها واسرشته شدند. از آنجا که DNA تک رشتهای قدرت تفکیک بیشتری بر روی ژل دارد و وضوح نوارهای آن نیز بر روی ژل بهتر است (کرست و همکاران، ۲۰۰۱)، بدین منظور نمونهها در دستگاه PCR در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه واسرشته شدند. تیوبهای حاوی نمونهها بلافاصله پس از واسرشتهسازی به داخل ظرف حاوی یخ منتقل و سریعا سرد شدند تا حالت تک رشتهایDNA حفظ شود و دو رشته مجددا به هم متصل نشوند. سپس دستگاه الکتروفورز به دستگاه تامین کننده برق متصل شد. توان مورد نیاز برای الکتروفورز به دمای مورد نیاز و فاصله دو قطب مثبت و منفی از یکدیگر بستگی دارد. در این حالت برای بارگذاری نمونهها توان ثابت ۷۰ وات در دمای ۵۰ درجه سانتیگراد مورد استفاده قرار گرفت. زمان الکتروفورز بستگی به وزن باندهای حاصل از PCR بر حسب جفت باز دارد که در این تحقیق با توجه به نتایج آزمایشات اولیه و بهینهسازی شرایط الکتروفورز، زمان مناسب برای تفکیک محصولات PCR از یکدیگر ۹۰-۴۵ دقیقه تشخیص داده شد. پس از پایان الکتروفورز جریان برق قطع شد و قالب ژل از دستگاه الکتروفورز جدا گردید. پس از جدا نمودن ظرف ژل از دستگاه الکتروفورز، ابتدا بافر موجود در قالب ژل تخلیه گردید و دو شیشه قالب ژل از یکدیگر جدا شدند، سپس شیشه بزرگتر که ژل به آن چسبیده بود جهت رنگ آمیزی به تشتک مخصوص منتقل گردید (ربیعی، ۱۳۸۲).

۳-۴-۳- رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره

رنگآمیزی و ظهور باندها با استفاده از روش نیترات نقره (کرست و همکاران، ۲۰۰۱) در چهار مرحله انجام شد:
۱- تثبیت نوارهای DNA در روی ژل با محلول تثبیت کننده[۶۴]، ۲- رنگ آمیزی ژل با محلول رنگ آمیزی[۶۵]، ۳- ظهور نوارهای روی ژل با محلول ظاهر کننده[۶۶] و ۴- توقف ظهور نوارها با محلول متوقف کننده[۶۷] که همان محلول تثبیت کننده میباشد. دمای محلول و مدت زمان قرارگیری ژل در هر یک از آنها، دو عامل مهم برای بدست آوردن نوارهای با وضوح بالا میباشند. برای انجام مراحل رنگ آمیزی، از تجربیات کرست و همکاران، ۲۰۰۱ و ربیعی، ۱۳۸۲ استفاده گردید. به منظور رنگآمیزی ژل پس از اتمام الکتروفورز و جدا نمودن شیشههای ظرف ژل از یکدیگر، صفحه شیشهای حاوی ژل به مدت ۲۰ دقیقه در تشتک حاوی محلول تثیبت کننده (اسید استیک به میزان ۱۰۰ میلیلیتر و آب دو بار تقطیر به مقدار ۹۰۰ میلیلیتر) قرار داده شد و در این مدت محلول به آرامی تکان داده شد. پس از آن ژل از محلول خارج شد و محلول تثبیت کننده در داخل شیشه مخصوص ریخته شد تا در مرحله توقف، مجددا مورد استفاده قرار گیرد. پس از آن شیشه ژل ۳ بار و هر بار به مدت ۲ دقیقه با آب مقطر آبشویی شد و سپس شیشه ژل به تشتک حاوی محلول رنگ آمیزی (نیترات نقره به میزان ۱ گرم، فرمالدئید ۳۷ درصد به اندازه ۵/۱ میلیلیتر و آب دو بار تقطیر تا حجم ۱۰۰۰ میلیلیتر) منتقل شد و به مدت ۳۰ الی ۴۵ دقیقه در محلول رنگآمیزی قرار داده و به آرامی تکان داده شد. کمی قبل از پایان مدت رنگ آمیزی، آب دو بار تقطیر (یک لیتر) و محلول ظاهر کننده (کربنات سدیم به مقدار ۳۵ گرم، فرمالدئید ۳۷ درصد ۵/۱ میلیلیتر، تیوسولفات سدیم ۱ درصد به میزان ۲۰۰ میکرولیتر مخلوط، آب دو بار تقطیر تا حجم کل ۱۰۰۰ میلیلیتر) از یخچال خارج شده و در تشتکهای مخصوص ریخته شدند. سپس ژل از محلول رنگ آمیزی خارج شد و به مدت ۳۰-۱۰ ثانیه در آب سرد شستشو داده شد و بلافاصله در محلول ظاهر کننده قرار گرفت. این محلول باید خنک و در دمای ۴ درجه سانتیگراد باشد. مدت زمان قرارگیری ژل در محلول ظاهر کننده متغیر بود و به دمای محلول فوق بستگی داشت. پس از آن ژل سریعا از محلول خارج شد و به تشتک حاوی محلول متوقف کننده که همان محلول تثبیت کننده اولیه بود منتقل شد تا ظهور نوارها متوقف شود. سپس ژل به تشتک آب مقطر منتقل گردید و دو بار با آب مقطر شسته شد. آنگاه شیشه حاوی ژل در محل مناسبی در محیط آزمایشگاه قرار گرفت تا خشک شود پس از آن شیشه و ژل چسبیده به آن به دستگاه اسکنر[۶۸] منتقل شد و برای تجزیه و تحلیلهای آماری اسکن گردید.

۳-۴-۴- امتیازدهی باندها

الگوی نواری نشانگرها به صورت وجود یا عدم وجود نوار خاص (یک و صفر) برای نشانگرهای غالب و نیز همبارز و به صورت فراوانیهای آللی برای نشانگرهای همبارز امتیازدهی میشود، زمانی که هدف برآورد فاصله یا شباهت ژنتیکی بین افراد باشد. در اکثر موارد نشانگرهای همبارز نیز مثل نشانگرهای غالب به صورت وجود یا عدم وجود آلل خاص امتیازدهی میشوند (یک و صفر) (محمدی، ۱۳۸۱). در این بررسی به منظور امتیازدهی باندها با استفاده از نرمافزار Pop Gen یه و همکاران (۱۹۹۹) از حروف الفبای انگلیسی استفاده شد. به طوری که سبکترین باند به عنوان اولین آلل با حرف A مشخص شد و با افزایش وزن باندها از حروف دیگر استفاده گردید. در هر ژنوتیپ وجود یک باند به منزله هموزیگوسیتی و مشاهده دو باند به منزله هتروزیگوسیتی منظور گردید. به منظور امتیازدهی باندها با استفاده از نرمافزار NTSYS pc 2.02 رلف (۲۰۰۲) الگوی نواری نشانگرها به صورت وجود یا عدم وجود نوار خاص (یک و صفر) در نظر گرفته شد.

۳-۵- تجزیههای آماری و نرمافزارهای مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل

الف- تجزیه و تحلیل دادههای مورفو فیزیولوژیک
از نرمافزار SPSS 16.0 (SPSS, 2007) برای محاسبه همبستگیها و تجزیه کلاستر (روش UPGMA ضریب مربع فاصله اقلیدسی) و همچنین تجزیه به مؤلفههای اصلی و از نرمافزار SAS v9.1 ((SAS, 1997 برای محاسبه مقایسه میانگینها و تجزیه واریانس صفات استفاده گردید.
ب- تجزیه و تحلیل دادههای ریزماهواره
از نرمافزار Pop Gene برای تجزیه و تحلیل پارامترهای مربوط به جمعیت مانند هموزیگوسیتی و هتروزیگوسیتی مورد انتظار و مشاهده شده، فراوانی آللها و تعداد آللهای مشاهده شده و مورد انتظار استفاده گردید (یه و همکاران، ۱۹۹۹). از نرمافزارNTSYS pc 2.02 برای به دست آوردن فواصل ژنتیکی و رسم دندروگرام و تجزیه به مؤلفههای اصلی استفاده گردید (رلف، ۲۰۰۲).
فصل چهارم:
نتایج و بحث

۴-۱- ارزیابی تحمل به شوری ارقام

۴-۱-۱- ارزیابی تحمل به شوری در مرحله گیاهچه و در شرایط کنترل شده

الف- تجزیه واریانس، مقایسه میانگینها و همبستگی صفات
اختلاف بین ژنوتیپها برای کلیه صفات معنیدار بود (جدول ۴-۱). این نتیجه بیانگر وجود تنوع ژنتیکی برای صفات ارزیابی شده در مرحله گیاهچهای در شرایط شوری در ژنوتیپهای مورد بررسی است. تفاوت بین سطوح مختلف شوری نیز از نظر کلیه صفات مورد بررسی معنیدار بود (جدول ۴-۱). با افزایش تنش شوری در ۸ دسیزیمنس بر متر طول ریشه، طول اندام هوایی (ساقه و برگ)، وزن خشک ریشه، وزن خشک اندام هوایی، زیستتوده (وزن کل گیاه)، سطح برگ و کلروفیل کاهش معنیداری پیدا کرد، در حالی که نسبت سدیم به پتاسیم افزایش معنیداری نشان داد. واکنش متفاوت ژنوتیپهای مورد بررسی نسبت به شدت تنش موجب شد که اثر متقابل ژنوتیپ×شوری نیز برای کلیه صفات مورد بررسی معنیدار گردد. به عبارت دیگر روند تغییرات یا تفاوت ژنوتیپها از نظر هر خصوصیت در دو سطح شور و شاهد متفاوت بود (جدول ۴-۱). امتیازدهی ژنوتیپها طبق روش گریگوریو و همکاران (۱۹۹۷) در شوری ۸ دسیزیمنس برمتر، ژنوتیپهای حساس و متحمل را تفکیک نمود (جدول ۴-۲). نتایج نشان داد که ژنوتیپهای غریب و شاهپسند و لاینهای، IR74099-3R-2-2، IR65-185-3B-8-3-2، IR63311-B-6-2-1-3، IR67075-2B-2-2 و IR65192-4B-6-1 متحمل و ژنوتیپهای خزر، سپیدرود، IR50، IR28، IR74095-AC40 و IR65195-3B-19-1-1 حساس میباشند. در بین ژنوتیپهای مورد بررسی، غریب، شاهپسند، IR59418-7B-20-1، IR59418-7B-19-2، IR65192-3B-1-1-3، IR74099-3R-2-3، IR63311-B-6-2-1-3 دارای زیستتوده بالاتری نسبت به سایر ژنوتیپها بودند (شکل۴-۱). صبوری و همکاران (۱۳۸۸) نیز گزارش نمودند که ارقام متحمل، زیست تودهبالا و نسبت سدیم به پتاسیم کمتری دارند. در بین ژنوتیپهای متحمل، ژنوتیپهای IR65192-4B-6-1، IR67075-2B-2-2، IR65-185-3B-8-3-2 و IR74099-3R-2-2، زیستتوده پایین
تری داشتند. به نظر میرسد که این ارقام از سازوکار دیگری مانند تجمع اسمیلاتها در درون سلولها جهت مقابله با شوری استفاده میکنند. ژنوتیپهای حساس خزر، سپیدرود، IR50، IR28، IR65192-4B-4-2 و IR65195-3B-19-1-1زیستتوده کمتری داشتند.
جدول ۴-۱- تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه به صورت کرتهای خرد شده در قالب طرح بلوک کامل تصادفی

منابع تغییرات درجه آزادی میانگین مربعات
طول
ریشه
طول
اندام هوایی
وزن خشک ریشه وزن خشک اندام هوایی سطح برگ کلروفیل زیست توده نسبت سدیم به پتاسیم
برای دانلود فایل متن کامل پایان نامه به سایت 40y.ir مراجعه نمایید.
Copyright © All rights reserved. | Newsphere by AF themes.