ژانویه 24, 2021

پژوهش دانشگاهی – پاسخ های رویشی، فیزیولوژیکی و ژنتیکی دو گونه بلوط زاگرس۹۳(Q.brantii و Q. libania)تحت تنش خشکی- …

1 min read

نمونههای برگ، ریشه و ساقه در آون با دمای ۴۰۰ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت خشک شدند پس از آن از هر اندام به اندازه ۱/۰ گرم وزن شدند (نمونههایی با وزن کمتر از ۱/۰ گرم یادداشت شدند) و در بوتههای چینی در کوره با دمای ۵۰۰ درجه سانتیگراد به مدت ۴ ساعت قرار داده شدند. بعد از گذشت مدت زمان لازم نمونههای پودر شده با ۱ میلی لیتر اسیدکلریدریک ۱ نرمال و ۹ میلیلیتر آب دو بار تقطیر به حجم ۱۰ سیسی رسانده شده سپس با استفاده از کاغذ صافی عصاره مورد نظر صاف شد.

  1. اندازهگیری

اندازهگیری سدیم و پتاسیم قابل جذب هر یک از اندامهای برگ، ریشه و ساقه توسط دستگاه فلمفتومتری انجام گرفت، قبل از قرائت مقادیر نمونهها مقادیر سدیم و پتاسیم استانداردها توسط دستگاه فلمفتومتری قرائت شد که با داشتن اعداد بهدست آمده یک منحنی استاندارد (مرجع) رسم شد و سپس سدیم و پتاسیم نمونهها قرائت شد که با تطبیق دادن با منحنی استاندارد غلظت سدیم و پتاسیم هر یک از اندامهای برگ، ریشه و ساقه بر حسب ppm بهدست آمد در نهایت مقدار سدیم و پتاسیم از طریق رابطه زیر بر حسب میلیگرم بر گرم بهدست آمد:
معادله ۳-۱۱ X=C×۱۰/M×۱۰۰۰
X= مقدار سدیم و پتاسیم قابل جذب توسط گیاه بر حسب میلیگرم بر گرم
C= مقدار سدیم و پتاسیم قابل جذب توسط گیاه به میلیگرم بر لیتر (ppm)
۱۰= حجم هر نمونه (عصاره)
M= وزن هر نمونه
ب- فسفر
۱- عصارهگیری
با همان روش عصارهگیری سدیم و پتاسیم صورت گرفت.
۲-تهیه استوک فسفر (یک مولار)
میزان ۲۱۹۵/۰ KH2PO4 وزن گردید و با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد و سپس برای تهیه استاندارد استوک به نسبت ۱:۵۰ رقیق گردید.
۳-تهیه معرف A
۵/۲۲گرم آمونیوم مولیبدات وزن گردید و ۴۰۰ میلیلیتر آب دو بار تقطیر به آن اضافه شد.
۴-تهیه معرف B
معرف در همان روزی که استفاده میشود باید تهیه شود و تهیه آن به این صورت است که ۲۵/۱ گرم آمونیوم وانادیات وزن شد و سپس ۳۰۰ میلیلیتر آب دوبار تقطیر اضافه شد و گرم میشود تا به خوبی حل گردد.
۵-تهیه معرف اصلی
معرف با معرف مخلوط و به حجم یک لیتر رسانده میشود تا به دمای اتاق برسد. سپس ۲۵۰ میلیلیتر اسید نیتریک یک نرمال به محلول اضافه میکنیم.
۶-روش اندازهگیری فسفر
یک میلیلیتر از نمونه در استوانه مدرج ریخته میشود و ۵ میلی لیتر از معرف اصلی فسفر به آن اضافه گردید و سپس با آب دو بار تقطیر به حجم ۱۰ رسانده شد و عصاره تهیه شده کمی به هم زده شد تا نهایتا بعد از نیم ساعت به رنگ زرد در آید. برای اندازهگیری میزان فسفر هر یک از اندامها باید قبل از شروع استانداردهای ۰ ،۵ ،۱۰، ۱۵، ۲۰، ۲۵ را با دستگاه اسپکتوفتومتر با طول موج۴۷۰ (نانومتر) در حالت انتقال (Trans) قرائت گردید که با داشتن اعداد بهدست آمده یک منحنی استاندارد (مرجع) رسم شد و سپس عدد عصاره نمونهها قرائت شد و با تطبیق دادن با منحنی استاندارد غلظت فسفر بر اساسppm مشخص شد. سپس با استفاده از معادله ۳-۱۱ به میلیگرم در گرم تبدیل شد.
۳-۵- مطالعات مولکولی
۳-۵-۱- استخراج (RNA)
جهت استخراج RNA باید از قبل تمام وسایل مورد نیاز جهت انجام عمل استخراج اتوکلاو شده باشند و تا جایی که امکان دارد از برخورد مستقیم دست با وسایل خودداری شود و در حین کار از دستکش استفاده شود. نمونههای برگ و ریشه در روز برداشت از نمونهها جمعآوری شدند و در دمای c°۴۰- نگهداری شدند. برای استخراج RNA در دو روز پیدر پی عمل استخراج انجام شد.
۳-۶-۱روز اول
۱۰۰ تا ۲۰۰ میلیگرم از نمونهها را همراه با ازت مایع در هاون چینی کوبیده و در میکروتیوپهای ۵/۱ میلیلیتری ریخته شدند (میکروتیوپها باید درون ازت مایع قرار بگیرند). بعد از مرحله کوبیدن نمونهها ۱ میلیلیتر از بافر استخراج به نمونههای کوبیده شده اضافه گردید و درون بن ماری با دمای ۶۵ به مدت ۵ دقیقه قرار داده شد و هر ۲ دقیقه یکبار نمونهها از بنماری بیرون آورده و ورتکس شدند. پس از آن ۲۰ میکرولیتر مرکاپتواتانول به نمونهها اضافه و به مدت ۱۵ ثانیه ورتکس شدند. سپس مجددا نمونهها به مدت ۱۰ دقیقه در بنماری با دمای ۶۵ درجه قرار گرفتند و هر ۳ دقیقه یکبار با دست ورتکس شدند. پس از اینکه نمونهها از بنماری بیرون آورده شدند به اندازه ۱ واحد از حجم نمونهها کلروفورم ایزوآمیلالکل به نمونهها اضافه شدند (کلروفورم ایزوآمیلالکل به نسبت ۱:۲۴ تهیه شد). سپس نمونهها توسط سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه در دمای اتاق (۲۵ درجه سانتیگراد) به مدت ۱۰ دقیقه مخلوط شدند و در نهایت مایع رویی به میکروتیوپ جدید منتقل شد. مجدداً ۱ واحد کلروفورم ایزوآمیل الکل اضافه شد و توسط ورتکس مخلوط شدند. بعد از این مرحله نمونهها درون سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه و دمای اتاق به مدت ۱۰ دقیقه قرار گرفتند. مجددا مایع رویی به تیوپ جدید منتقل شد و پس از آن به اندازه یک چهارم حجم مایع رویی لیتم کلراید سرد (۱۰مولار) (از قبل در دمای ۴- درجه قرار داده شدند) اضافه کرده و نهایتا ورتکس شدند و در دمای ۴- درجه سانتیگراد به مدت ۱ شب قرار گرفتند.
۳-۶-۲ روز دوم
نمونههای آماده شده از روز قبل را که درون یخچال بودند، درون سانتریفیوژ با ۹۰۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ دقیقه قرارگرفتند. در این مرحله لکهRNA ته میکروتیوب میچسبد و مایع رویی دور ریخته میشود و میکروتیوپها را به صورت وارونه قرار میدهیم تا پلتی که ته میکروتیوپ هست، کاملا خشک شود. پس از آن ۵۰۰ میکرو لیتر بافر STE (بدون SDD) به پلت اضافه شد و در بنماری با دمای ۶۵ درجه سانتیگراد قرار میدهیم و هر چند دقیقه یکبار با دست تکان داده شد تا پلت در محلول بافر خوب حل شود. در مرحلهی بعد ۴۵۰ میکرولیتر کلروفورم ایزوآمیل الکل به میکروتیوپ حاوی پلت و بافر STE اضافه و نهایتا ورتکس شدند. سپس نمونهها در سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه قرار میدهیم. بعد از آن مایع رویی را به میکروتیوپ جدید منتقل شد (تیوپها در ظرف یخ قرار گیرند). پس از آن که مایع رویی به میکروتیوپ جدید منتقل شد، ۱۵۰ میکرولیتر بافر STE مجددا به مایع درون میکروتیوپ اضافه و ورتکس شد. مجدداً در سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه و دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده شد، سپس مایع رویی وارد میکروتیوپ جدید شد. پس از آن ۶۰۰ میکرولیتر استات سدیم ۳ مولار به محتوای تیوپ اضافه کرده و ۵/۲ برابر حجم آن اتانول ۱۰۰% (از قبل در دمای ۲۰- درجه گذاشته شود) اضافه شد و نهایتا ورتکس شد و به مدت ۲ ساعت در یخچال ۲۰- درجه قرارگرفتند. بعد از آنکه نمونهها از یخچال بیرون آورده شدند و در سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ دقیقه قرار گرفتند. پس از آن مایع رویی دور ریخته شد و میکروتیوپ به حالت وارونه قرار گرفتند تا پلتی که ته میکروتیوپ چسبیده بود کاملا خشک شود. در مرحلهی بعد ۴۰۰ میکرولیتر اتانول ۷۰% (از قبل در دمای ۲۰- درجهسانتی گراد گذاشته شود) اضافه میکنیم و ورتکس میشود. در نهایت نمونهها در سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه قرار گرفتند، بعد از آن مایع رویی دور ریخته شد و پلت خشک شد، سپس ۳۰ میکرولیتر آب دبس به هر نمونه اضافه شد.
۳-۵-۲-تهیه ژل آگارز (یک درصد)
۵/۱ گرم آگارز توزین و با ۷۲ میلیلیتر آب دوبار تقطیر مخلوط و در ماکروویو به مدت یک دقیقه قرار داده شد تا حل گردد. بعد از حل شدن ژل، به مدت چند ثانیه ظرف حاوی ژل را زیر هود قرار گرفت تا سرد شود (دما به ۵۵ درجه سانتیگراد برسد). پس از آن ۱۰ میلیلیتر بافر موپس ] X10[ به آرامی به ژل اضافه کرده و بعد از آن ۱۸ میلیلیتر فرمالدهید اضافه کرده و در نهایت ۵ میکرولیتر اتیدیوم بروماید اضافه و با آب دبس به حجم ۱۰۰میلیلیتررسانده شد.
۳-۵-۳- تهیه loding day
Loding day طی ۳ مرحله تهیه میشود.
مرحله اول – تهیه بافر نمونه (Sample buffer) : ۲ میکرولیتر بافر موپس ] X10 [با ۴ میکرولیتر فرمالدهید و ۱۰ میکرولیتر فرمامید و ۱ میکرولیتر اتیدیوم بروماید (۲۰۰میکروگرم) مخلوط میکنیم (مقادیر بالا جهت تهیه یک نمونه است). این محلول در دمای ۲۰- درجه نگهداری میشود و به مدت ۶ ماه قابل استفاده میباشد.
مرحله دوم – تهیه بافر بارگذاری ((Loding buffer: 4/0% بروموفنولبلو با ۱ میلیگرم در میلیلیتر اتیدیوم بروماید و ۱ میلی مولار EDTA و ۲ میلیلیتر گلیسرول مخلوط در نهایت با آب دبس به حجم ۴ میلیلیتر رسانده شد.
مرحله سوم – تهیه رنگ بارگذاری (Loding day): 4 میکرولیتر از RNAی نمونه با ۸ میکرولیتر از Sample buffer مخلوط و در بنماری با دمای ۷۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه قرار گرفتند. بعد از آن ۲ میکرولیتر RNA Loding buffer اضافه شد، سپس نمونهها درون ژل آگارز در چاهکهای مورد نظر Run شدند و به مدت ۴۵ دقیقه در دستگاه الکتروفورز با ولتاژ قرار گرفتند و بعد از آن توسط دستگاه ژل داک از ژل مورد نظر تصویربرداری شد.
۳-۵-۴- تهیه MOPS [۱] (محلول تانک)
موپس [X ۱۰] و آب دو بار تقطیر با نسبت ۹:۱ با هم مخلوط شد.

منبع فایل کامل این پایان نامه این سایت pipaf.ir است

Copyright © All rights reserved. | Newsphere by AF themes.